高校生物のサンガー法について解説。練習問題付き。

2025年3月5日

高校生物のサンガー法についてわかりやすく解説します。高末尾に練習問題もありますので、理解度の確認に利用してください。

サンガー法とは？

サンガー法（サンガーシーケンシングとも呼ばれる）は、DNAの塩基配列を調べるための方法です。基本的な流れは以下の通りです。

DNAの複製
DNAを増幅するため、まずDNAポリメラーゼという酵素と、通常のヌクレオチド（dNTP）を使って新しいDNA鎖を作ります。
チェーン終了反応
増幅反応に、少量のジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を混ぜます。ddNTPは、通常のヌクレオチドとは異なり、次のヌクレオチドが連結できないため、DNA鎖の伸長を途中で止めます。これにより、DNA鎖は様々な長さで終了し、複数の断片ができます。
断片の大きさによる分離
得られたDNA断片は、ゲル電気泳動という方法を使って大きさごとに分離されます。小さい断片から順に並ぶことで、どの位置で伸長が止まったかが分かります。
塩基配列の決定
ゲル上の断片の並びから、各断片の末端にどのddNTPが取り込まれたかを読み取ることで、元のDNAの塩基配列がわかります。

この方法は、正確にDNAの配列を解読できるため、遺伝子研究や病気の診断など、さまざまな分野で利用されています。

手順の詳細

サンガー法は、DNAの塩基配列を正確に決定するための方法で、以下のようなステップで行われます。

1. テンプレートDNAとプライマーの準備

テンプレートDNA: 配列を解読したいDNAサンプルを用意します。
プライマー: テンプレートDNAの特定部分に相補的な短い一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド）を設計し、結合させます。プライマーはDNA合成の開始点となります。

2. 反応混合物の調製

必要な成分: DNAテンプレート、プライマー、DNAポリメラーゼ、通常のヌクレオチド（dNTP）、そしてごく少量のジデオキシヌクレオチド（ddNTP）が含まれます。
ddNTPの特徴: ddNTPは通常のヌクレオチドと似ていますが、3’末端に‐OH基を持たないため、DNA鎖に取り込まれるとそれ以降のヌクレオチドの連結ができなくなり、合成がそこで停止します。各ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）には識別可能なラベルが付加されることが多いです。

3. DNA合成と鎖終了反応

ポリメラーゼによる伸長: DNAポリメラーゼは、プライマーに沿ってdNTPを取り込みながら新しいDNA鎖を合成します。
ランダムな鎖終了: 反応系中にごく少量混ざっているddNTPがランダムに取り込まれると、その時点で鎖の伸長が停止します。結果、プライマー開始位置からddNTPが取り込まれた位置までの、長さの異なるDNA断片が多数生成されます。
別々の反応: 古典的な方法では、4種類のddNTPそれぞれを含む4つの反応チューブで行い、各断片の末端の塩基を個別に特定できるようにします。

4. DNA断片の分離

電気泳動による分離: 得られたDNA断片は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）などの方法で、断片の長さに応じて分離されます。断片は大きさにより異なる位置に移動し、小さい断片ほどゲル内を速く移動します。
可視化: 断片が分離された後、ラベルに応じて放射線感受性や蛍光検出により、各断片の位置を視覚的に確認します。

5. 塩基配列の解読

断片パターンの読み取り: ゲル上に現れる各断片の位置（すなわち断片の長さ）と、末端に組み込まれたddNTPの種類から、元のDNAの塩基配列が決定されます。
配列の復元: プライマーから始まる各断片は、どこで合成が停止したかの情報を持っており、4つの反応チューブの結果を照らし合わせることで、断片がどの順序で並んでいるかが明らかになり、完全な塩基配列が読み取られます。

6. 解析と現代の応用

解析方法: 断片のパターンを元に、手作業または専用のソフトウェアで配列情報が組み立てられます。
自動化: 現在では、4種類のddNTPに異なる蛍光色素を付け、単一の反応系で行い、キャピラリー電気泳動などの自動装置で高速かつ高精度に配列を読み取る方法が主流となっています。

サンガー法のメリット・デメリット

メリット	デメリット
高精度でDNAの配列を決定できる	一度に読める塩基数が少ない（数百塩基程度）
単一のDNAサンプルでも解析可能	大量のDNA配列解析には不向き
低コストで確実な結果が得られる	次世代シーケンシング（NGS）より時間がかかる

サンガー法に関する練習問題

サンガー法で用いられる特殊なヌクレオチドは何か？
- dNTP（デオキシヌクレオチド三リン酸）
- ddNTP（ジデオキシヌクレオチド三リン酸）
- rNTP（リボヌクレオチド三リン酸）
- ATP（アデノシン三リン酸）
サンガー法においてDNA鎖の合成が停止するのは、どのような構造を持つヌクレオチドが取り込まれたときか？
サンガー法によるDNAシーケンシングで用いる4種類のddNTPを挙げ、それぞれの対応する塩基を答えなさい。
サンガー法で得られるDNA断片の長さが異なる理由を説明しなさい。
サンガー法では、標的DNAを鋳型として用いるが、その増幅にはどの酵素を用いるか？
- DNAヘリカーゼ
- RNAポリメラーゼ
- DNAポリメラーゼ
- リガーゼ

練習問題の解答例

サンガー法で用いられる特殊なヌクレオチドは何か？
答え:
② ddNTP（ジデオキシヌクレオチド三リン酸）

2. サンガー法においてDNA鎖の合成が停止するのは、どのような構造を持つヌクレオチドが取り込まれたときか？
答え:
3’位のヒドロキシ基（-OH）がない「ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）」が取り込まれたとき。ddNTPには3’位の-OHがないため、新しいヌクレオチドが結合できず、DNA鎖の伸長が停止する。

3. サンガー法で用いる4種類のddNTPと対応する塩基は？
答え:

ddATP → A（アデニン）
ddTTP → T（チミン）
ddGTP → G（グアニン）
ddCTP → C（シトシン）

4. サンガー法で得られるDNA断片の長さが異なる理由を説明しなさい。
答え:
DNA鎖の合成中にランダムにddNTPが取り込まれ、それぞれ異なる位置で合成が停止するため。

5. サンガー法で鋳型DNAを増幅する際に用いる酵素は？
答え:
③ DNAポリメラーゼ

まとめ

サンガー法は、DNAの塩基配列を読むための方法で、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を使ってDNAの合成を止めることで、様々な長さのDNA断片を作り、それを電気泳動で分析する ことで配列を決定します。現在では次世代シーケンシング（NGS） が主流ですが、サンガー法は短いDNAの正確な解析 などで今も使われています。