高校生物のサンガー法についてわかりやすく解説します。高末尾に練習問題もありますので、理解度の確認に利用してください。
サンガー法とは？
サンガー法（サンガーシーケンシングとも呼ばれる）は、DNAの塩基配列を調べるための方法です。基本的な流れは以下の通りです。
- DNAの複製
DNAを増幅するため、まずDNAポリメラーゼという酵素と、通常のヌクレオチド（dNTP）を使って新しいDNA鎖を作ります。 - チェーン終了反応
増幅反応に、少量のジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を混ぜます。ddNTPは、通常のヌクレオチドとは異なり、次のヌクレオチドが連結できないため、DNA鎖の伸長を途中で止めます。これにより、DNA鎖は様々な長さで終了し、複数の断片ができます。 - 断片の大きさによる分離
得られたDNA断片は、ゲル電気泳動という方法を使って大きさごとに分離されます。小さい断片から順に並ぶことで、どの位置で伸長が止まったかが分かります。 - 塩基配列の決定
ゲル上の断片の並びから、各断片の末端にどのddNTPが取り込まれたかを読み取ることで、元のDNAの塩基配列がわかります。
この方法は、正確にDNAの配列を解読できるため、遺伝子研究や病気の診断など、さまざまな分野で利用されています。
手順の詳細
サンガー法は、DNAの塩基配列を正確に決定するための方法で、以下のようなステップで行われます。
1. テンプレートDNAとプライマーの準備
- テンプレートDNA: 配列を解読したいDNAサンプルを用意します。
- プライマー: テンプレートDNAの特定部分に相補的な短い一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド）を設計し、結合させます。プライマーはDNA合成の開始点となります。
2. 反応混合物の調製
- 必要な成分: DNAテンプレート、プライマー、DNAポリメラーゼ、通常のヌクレオチド（dNTP）、そしてごく少量のジデオキシヌクレオチド（ddNTP）が含まれます。
- ddNTPの特徴: ddNTPは通常のヌクレオチドと似ていますが、3’末端に‐OH基を持たないため、DNA鎖に取り込まれるとそれ以降のヌクレオチドの連結ができなくなり、合成がそこで停止します。各ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）には識別可能なラベルが付加されることが多いです。
3. DNA合成と鎖終了反応
- ポリメラーゼによる伸長: DNAポリメラーゼは、プライマーに沿ってdNTPを取り込みながら新しいDNA鎖を合成します。
- ランダムな鎖終了: 反応系中にごく少量混ざっているddNTPがランダムに取り込まれると、その時点で鎖の伸長が停止します。結果、プライマー開始位置からddNTPが取り込まれた位置までの、長さの異なるDNA断片が多数生成されます。
- 別々の反応: 古典的な方法では、4種類のddNTPそれぞれを含む4つの反応チューブで行い、各断片の末端の塩基を個別に特定できるようにします。
4. DNA断片の分離
- 電気泳動による分離: 得られたDNA断片は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）などの方法で、断片の長さに応じて分離されます。断片は大きさにより異なる位置に移動し、小さい断片ほどゲル内を速く移動します。
- 可視化: 断片が分離された後、ラベルに応じて放射線感受性や蛍光検出により、各断片の位置を視覚的に確認します。
5. 塩基配列の解読
- 断片パターンの読み取り: ゲル上に現れる各断片の位置（すなわち断片の長さ）と、末端に組み込まれたddNTPの種類から、元のDNAの塩基配列が決定されます。
- 配列の復元: プライマーから始まる各断片は、どこで合成が停止したかの情報を持っており、4つの反応チューブの結果を照らし合わせることで、断片がどの順序で並んでいるかが明らかになり、完全な塩基配列が読み取られます。
6. 解析と現代の応用
- 解析方法: 断片のパターンを元に、手作業または専用のソフトウェアで配列情報が組み立てられます。
- 自動化: 現在では、4種類のddNTPに異なる蛍光色素を付け、単一の反応系で行い、キャピラリー電気泳動などの自動装置で高速かつ高精度に配列を読み取る方法が主流となっています。
サンガー法のメリット・デメリット
| メリット | デメリット |
|---|---|
| 高精度でDNAの配列を決定できる | 一度に読める塩基数が少ない（数百塩基程度） |
| 単一のDNAサンプルでも解析可能 | 大量のDNA配列解析には不向き |
| 低コストで確実な結果が得られる | 次世代シーケンシング（NGS）より時間がかかる |
サンガー法に関する練習問題
問題1.（選択問題）
サンガー法の基本原理として最も適切なものを、次の中から選びなさい。
A. DNAポリメラーゼがDNAを増幅する際、特定の塩基を選択的に除去する。
B. dideoxynucleotide (ddNTP) を用いてDNA鎖の合成をランダムに停止させ、断片長の違いから塩基配列を決定する。
C. RNAを鋳型として逆転写を行い、DNAを合成する。
D. DNA断片をクロマトグラフィーで分離し、塩基配列を解析する。
【問題1の解答】
B
問題2.（記述問題）
サンガー法において使用されるdideoxynucleotide（ddNTP）の特徴と、その役割について簡潔に説明しなさい。
【問題2の模範解答】
ddNTPは3′-ヒドロキシ基（3′-OH）を持たないため、DNAポリメラーゼが取り込むとDNA鎖の伸長がそこで停止する。これにより、各ddNTPが取り込まれた位置で断片が生成され、断片の長さから元のDNA配列が決定できる。
問題3.（選択問題）
サンガー法の反応でDNA鎖の伸長を行う酵素はどれか。
A. RNAポリメラーゼ
B. DNAリガーゼ
C. DNAポリメラーゼ
D. プライマーゼ
【問題3の解答】
C
問題4.（穴埋め問題）
サンガー法では、ddNTPは通常のdNTPと異なり、_________が欠如しているため、DNA鎖の伸長が停止する。
【問題4の解答】
3′-ヒドロキシ基（3′-OH）
問題5.（選択問題）
サンガー法で生成されたDNA断片の大きさに基づいて分離し、塩基配列を解析するために一般的に用いられる手法はどれか。
A. 電気泳動
B. ガスクロマトグラフィー
C. 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
D. 質量分析
【問題5の解答】
A
問題6.（記述問題）
サンガー法において、各ddNTPに蛍光色素を結合して使用する理由とそのメリットについて説明しなさい。
【問題6の模範解答】
蛍光色素で標識されたddNTPを使用することで、各DNA断片の末端に結合したddNTPの種類（A、T、G、C）を自動検出装置で識別できるようになる。これにより、迅速かつ正確な塩基配列の決定が可能となる。
問題7.（記述問題）
サンガー法の反応条件で、ddNTPとdNTPの濃度比を調整する理由を説明しなさい。
【問題7の模範解答】
ddNTPはdNTPに比べ低濃度で反応系に添加される。これにより、DNA鎖の伸長がランダムに停止する確率が適度に調整され、さまざまな長さの断片が生成されることで、断片の大きさ分布から正確な配列決定が可能となる。
問題8.（論述問題）
サンガー法の原理、手順、およびその応用例（例：遺伝子解析や突然変異の検出など）について、200字程度で説明しなさい。
【問題8の模範解答】
サンガー法は、DNA鎖合成反応において、通常のdNTPと低濃度のddNTPを混合して行う。ddNTPは3′-OHが欠如しているため、取り込まれるとその時点で伸長が停止する。各ddNTPには蛍光色素が結合しており、生成されたDNA断片を電気泳動で大きさ別に分離後、蛍光検出により末端の塩基が識別される。これにより、遺伝子解析や突然変異の検出などに応用される有効な手法となっている。
電気泳動の基礎練習問題
【問題1】（選択問題）
【問題内容】
サンガー法による電気泳動では、DNA断片の分子量が小さいほど、ゲル中のどの位置に移動しやすいか、以下の中から正しいものを選びなさい。
A. ゲルの上部
B. ゲルの下部
C. ゲルの中央
D. ゲル全体に均等に分布
【模範解答】
B
【問題2】（穴埋め問題）
【問題内容】
サンガー法の電気泳動において、DNA断片は分子量が_なほど、ゲル内でより遠くまで移動する。
【模範解答】
小さい
【問題3】（○×問題）
【問題内容】
サンガー法では、ddNTPの取り込みによりDNA鎖の伸長が停止し、その停止位置が電気泳動図で確認できる。
→ この記述は、○（正しい）か×（誤り）か、答えなさい。
【模範解答】
○
【問題4】（記述問題）
【問題内容】
下から順に読み取った場合、サンガー法の電気泳動図で、各位置で観察されたバンドが以下の通りだったとします。
- 位置1：ddGTPレーン
- 位置2：ddATPレーン
- 位置3：ddTTPレーン
- 位置4：ddCTPレーン
この場合、5’から3’へ読み取ったDNA塩基配列を答えなさい。
【模範解答】
5′-G A T C-3′
以下は、サンガー法による電気泳動結果の解析に焦点を当てた、思考力が問われる練習問題の例です。各問題は、実際の実験結果（電気泳動図）の状況を想定し、配列の読み取りやエラーの原因究明、実験計画の改善点などを自ら考察することを目的としています。以下、問題と模範解答例（例示）を示します。
電気泳動の応用練習問題
【問題1】電気泳動図からの配列決定
【問題内容】
サンガー法によるDNA配列決定実験で得られた電気泳動図は、4本のレーン（それぞれddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP反応に対応）から構成されています。電気泳動図では、分子量が小さいDNA断片ほどゲル内を長く移動します。実験では、下から上へ読み進めると、各位置で現れるバンドがその位置で合成が停止した塩基を示します。
以下のパターンが得られたとします（「位置番号」は下から順に読んだ順番を示す）：
- 位置1：ddGTPレーンにのみバンドが認められる
- 位置2：ddTTPレーンにのみバンドが認められる
- 位置3：ddATPレーンにのみバンドが認められる
- 位置4：ddCTPレーンにのみバンドが認められる
- 位置5：ddGTPレーンにのみバンドが認められる
- 位置6：ddTTPレーンにのみバンドが認められる
- 位置7：ddATPレーンにのみバンドが認められる
- 位置8：ddCTPレーンにのみバンドが認められる
（1）この電気泳動図から読み取れる5’から3’へのDNA塩基配列を求めなさい。
（2）もし、実験中に最下部（位置1）のddGTPレーンのバンドが検出されなかった場合、配列決定にどのような影響が及ぶか、考察しなさい。
【模範解答例】
(1) 下から順に各位置のバンドが示す塩基は以下の通りとなる：
- 位置1：G
- 位置2：T
- 位置3：A
- 位置4：C
- 位置5：G
- 位置6：T
- 位置7：A
- 位置8：C
したがって、配列は 5′-G T A C G T A C-3′ となる。
(2) 位置1のddGTPバンドが検出されなかった場合、配列の最初の塩基が不明となるため、配列全体の読み取りがずれる可能性がある。特に、開始部位が正確に決定できなくなることで、以降の塩基の並びも誤って解釈されるリスクが高くなる。また、実験データの信頼性が低下し、再実験や他の確認手法の併用が必要になる可能性がある。
【問題2】電気泳動図の不整合現象の解析
【問題内容】
サンガー法による実験で得られた電気泳動図を解析していたところ、以下の異常が確認されました。
- 現象A： ddTTPレーンの位置4において、通常は単一のバンドが現れるはずが、二重のバンドが観察された。
- 現象B： ddCTPレーンの位置6において、バンドが全く観察されなかった。
それぞれの現象について、以下の問いに答えなさい。
（1）現象A（二重バンド）が生じる可能性のある実験上の原因について、既知のサンガー法の原理に基づいて考察しなさい。
（2）現象B（バンド消失）の原因として考えられる要因と、それに対する実験上の対策を具体例を挙げて説明しなさい。
【模範解答例】
(1) 二重バンドが現れる可能性としては、プライマーの非特異的結合やテンプレートDNAの劣化、あるいは反応系内でのddNTPの濃度ムラなどが考えられる。これにより、同一位置付近で複数のDNA断片が生成され、二重に見える現象が発生する可能性がある。
(2) バンドが全く観察されない場合、ddCTPの反応液の調製不良、あるいは試薬の劣化、または電気泳動条件（例えばゲル濃度や電圧設定）の不適切さが考えられる。対策としては、ddCTP試薬の有効性を再確認し、適正な濃度管理を徹底すること、また、電気泳動装置の設定やゲル調製方法を見直すことが挙げられる。
【問題3】電気泳動図のパターンから実験改善の提案
【問題内容】
あるサンガー法実験で、電気泳動図から以下の異常パターンが読み取られました。
- 複数の連続した位置において、同じddNTPレーンからのバンドが極端に強く、他のレーンとのバランスが崩れている。
- 特定のddNTPレーンでのみ、断片のバンドが散発的に弱くなっている部分がある。
（1）これらの現象が示す実験上の問題点を、サンガー法の基本原理に照らし合わせて考察しなさい。
（2）上記の異常を改善するために、実験条件や手順のどの部分を見直すべきか、具体的な改善策を提案しなさい。
【模範解答例】
(1) 連続した位置で特定のddNTPレーンのバンドが極端に強い場合、ddNTPとdNTPの濃度比が不適切であり、該当するddNTPの取り込み確率が高すぎる可能性がある。また、断片のバンドが弱い部分は、反応液の試薬混合や酵素活性のムラ、もしくは一部の反応系において反応が十分に進行していないことが示唆される。
(2) 改善策としては、ddNTPとdNTPの濃度比を再評価・調整すること、各試薬の品質および保管状態の確認、さらに反応条件（温度、反応時間など）の最適化が挙げられる。また、電気泳動時のゲルの作製や電圧設定も再検討し、均一な分離が得られるようにすることが望ましい。
まとめ
サンガー法は、DNAの塩基配列を読むための方法で、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を使ってDNAの合成を止めることで、様々な長さのDNA断片を作り、それを電気泳動で分析する ことで配列を決定します。現在では次世代シーケンシング（NGS） が主流ですが、サンガー法は短いDNAの正確な解析 などで今も使われています。
